En 1997, a Cash le fue diagnosticada una enfermedad neurodegenerativa conocida como síndrome de Shy-Drager, un diagnóstico posteriormente reemplazado por el de neuropatía autonómica asociada a la diabetes. La enfermedad forzó a Cash a acortar su gira. Fue hospitalizado en 1998 debido a una neumonía severa que le ocasionó daños en los pulmones. En consecuencia, los dos siguientes trabajos de la serie American Recordings, American III: Solitary Man (2000) y American IV: The Man Comes Around (2002), incluyeron canciones con un tono más reflexivo e introspectivo en comparación con sus dos primeros trabajos para el sello. El videoclip de «Hurt», una versión de una canción de Nine Inch Nails publicada como primer sencillo de American IV, obtuvo el respaldo de crítica: ganó un MTV Video Music Awards en la categoría de mejor cinematografía en 2003 y un Grammy al mejor video musical en 2004. En 2008, Cash volvió a recibir un Grammy en la misma categoría por el videoclip de «God’s Gonna Cut You Down», canción publicada en American V.
Su esposa durante 35 años, June Carter Cash, falleció el 15 de mayo de 2003 a la edad de 73 años. Sobre su esposa, el músico comentó en Cash y Carr (2003): «La única queja que tengo es que su contribución al country pasará desapercibida porque es mi esposa». Según comentó el propio Cash, antes de su muerte June le animó a que siguiese trabajando, algo que el músico cumplió, llegando a completar más de sesenta grabaciones en sus últimos cuatro meses de vida. Incluso llegó a ofrecer varios conciertos en The Carter Family Fold, a las afueras de Bristol (Virginia). En su última aparición pública, el 5 de julio de 2003, antes de interpretar «Ring of Fire», Cash leyó una declaración que había escrito poco antes de subir al escenario:
El 12 de septiembre, apenas cuatro meses después de la muerte de su esposa, Cash falleció en el Baptist Hospital de Nashville por complicaciones de diabetes. El músico fue enterrado al lado de su esposa en el Hendersonville Memory Gardens de Hendersonville, Tennessee. Apenas un año después, American Recordings publicó la caja recopilatoria Unearthed, recopilada por el propio músico antes de su muerte, que incluyó cuatro discos con grabaciones inéditas. Una de las últimas colaboraciones con Rick Rubin, American V: A Hundred Highways, fue publicado de forma póstuma el 4 de julio de 2006. El álbum se convirtió en el primer y único trabajo de Cash en debutar en el primer puesto de la lista Billboard 200. Un segundo trabajo póstumo, American VI: Ain’t No Grave, fue publicado el 23 de febrero de 2010, tres días antes del 78º cumpleaños de Cash.
En junio de 2005, la casa de Cash en Caudill Drive, Hendersonville, fue puesta en venta. Un año después, el cantante de Bee Gees Barry Gibb y su esposa Linda compraron la casa por 2,3 millones de dólares a través del hermano menor de Cash, Tommy Cash. Sin embargo, el 10 de abril de 2007, durante unas obras de restauración, la casa fue destruida en un incendio provocado por el uso de productos inflamables.